Microscopia de fluorescência: 5 fatos importantes que você deve saber

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O que é microscopia de fluorescência?

Microscópios de fluorescência um tipo de microscópio composto que funciona com várias variantes de fontes de luz com diferentes faixas de comprimento de onda para fluorescência de um espécime para produzir imagens que substituem o uso de transmissão, absorção, reflexão e espalhamento. Essas variantes microscópicas são usadas principalmente para observar amostras biológicas. A microscopia de fluorescência pode ser obtida usando o design simples de um microscópio de epifluorescência ou um microscópio con-focal complexo.

Como funciona a microscopia de fluorescência?

A amostra é mantida no estágio microscópico primeiro. A amostra é então iluminada dependendo da quantidade de luz necessária. Na microscopia de fluorescência, a luz de diferentes comprimentos de onda é usada para iluminar a amostra e essa luz é então absorvida pelo fluoróforos presente na amostra que emite um feixe de luz de comprimentos de onda mais longos ou de uma cor diferente da luz que entra. Um filtro de emissão espectral é usado para separar a luz emitida mais fraca da luz iluminante mais forte. Um microscópio de fluorescência geral tem as seguintes partes.

1. Um filtro de excitação.
2. Um espelho dicróico ou divisor de feixe.
3. Um filtro de emissão.
4. Uma fonte de luz (que pode ser uma lâmpada de arco de xenônio, lâmpada de vapor de mercúrio, LEDs de alta potência ou lasers).
5. Um conjunto de lentes objetivas.
6. Uma lente ocular.
7. Um palco para conter a amostra.
8. Um detector.

O divisor de feixe dicróico e os filtros de excitação e emissão são selecionados de forma que a excitação espectral seja compatível com as características de emissão do fluoróforo utilizado para rotular as amostras e é assim que a distribuição de uma única cor ou fluoróforo é detectada naquele momento . Para observar imagens multicoloridas, várias imagens de uma única cor precisam ser combinadas. Certos designs microscópicos vêm com um CCD (dispositivo de carga acoplada) no tubo do microscópio no lugar de uma lente ocular. Em um microscópio instalado com CCD, a formação da imagem ocorre na tela de um monitor colocando o CCD no plano intermediário da imagem.

O que é microscopia de epifluorescência?

Na microscopia de Epi-fluorescência, a excitação da amostra com fluorescência e a detecção da luz fluorescente emitida é feita seguindo o mesmo caminho da luz, ou seja, através da lente objetiva. Esses microscópios são especialmente usados ​​para observar amostras vivas. Para obter maior resolução das imagens, a abertura numérica da lente objetiva deve ser aumentada. A epifluorescência produz uma alta relação sinal-ruído, pois alguma quantidade de luz iluminante refletida se combina com a luz emitida pela amostra. Por esta razão, o divisor de feixe dicróico é usado. Este divisor de feixe atua como um filtro seletivo de comprimento de onda e transmite apenas a luz fluorescente emitida para a ocular ou lente ocular.

Quais são os deméritos da microscopia fluorescente?

1. Com a iluminação dos fluoróforos ao longo do tempo como resultado do processo de fotobranqueamento, os fluoróforos podem perder sua capacidade de fluorescência. O fotobranqueamento ocorre quando as moléculas fluorescentes sofrem gradativamente o dano químico devido à excitação dos elétrons durante a fluorescência. A fotodegradação pode afetar gravemente o período de tempo de observação de uma amostra por microscopia de fluorescência. 
2. A microscopia de fluorescência permitiu o exame de células vivas. No entanto, essas células vivas são propensas à fototoxicidade (principalmente com luz de comprimento de onda curto) e a molécula fluorescente pode produzir agentes reativos específicos quando iluminada, o que aumenta ainda mais o efeito fototóxico.
3. A microscopia de fluorescência pode permitir a imagem e observação de apenas algumas estruturas que foram marcadas para fluorescência. ou seja, uma amostra de tecido pode ser observada com a ajuda de microscopias de fluorescência se as amostras forem apresentadas com uma coloração fluorescente de DNA. Isso pode mostrar a organização do DNA dentro das células, mas não é capaz de revelar nada sobre a morfologia celular.

Como uma amostra fluorescente é preparada?

Sabemos que, a microscopia de fluorescência permite a imagem e observação de apenas algumas estruturas que foram marcadas para fluorescência. Portanto, a amostra a ser observada é tornada fluorescente por várias técnicas, tais como:

1. Manchas fluorescentes biológicas: Vários tipos de manchas fluorescentes são feitas, que são compatíveis com uma variedade de espécimes biológicos. Alguns exemplos de tais manchas de fluorescência são DRAQ7 e DRAQ5 (excitado por luz vermelha), Hoechst e DAPI (animado por luz ultravioleta de comprimento de onda), faloidina, Peptídeo de hibridização de colágeno, etc.
2. Imunofluorescência: A imunofluorescência é usada para ligar um anticorpo.
3. Proteínas fluorescentes: Proteínas fluorescentes são usadas para modificar o DNA de forma que as moléculas demonstrem fluorescência.

Para saber mais sobre microscópio composto visite https://techiescience.com/compound-microscope-working-5-important-uses/

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Sanchari Chakraborty

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