Reação em Cadeia da Polimerase: 9 Explicações Importantes

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O que é a reação em cadeia da polimerase?

reacção em cadeia da polimerase (PCR) é outro amplamente utilizado biologia molecular técnica para produzir DNA enzimaticamente sem utilizar maquinaria celular, por exemplo, levedura ou E. coli. O método permite uma quantidade limitada de DNA ser amplificado várias dobras dramaticamente. PCR é regularmente utilizado em clínico, forensee laboratórios biológicos para vários fins, como determinar impressões digitais genéticas, diagnóstico de doença, clonagem de genes, e teste de paternidade. 

Esta técnica foi criada em 1983 por Kary Mullis. PCR é atualmente um procedimento crucial e significativo usado em biologia aplicada. Estes incorporam Clonagem de DNA para sequenciamento, filogenia baseada em DNA ou investigação ativa da expressão gênica e determinação de doenças geneticamente transmissíveis. Em 1993, Mullis recebeu o prêmio Nobel de Química por seu trabalho em PCR. 

O PCR é geralmente realizado em uma mistura de reação de um volume total de 0.1-0.2 ml em tubos de reação (volumes de 0.2-0.5 ml) em um instrumento conhecido como um termociclador. Um termociclador aquece e resfria o DNA para atingir as temperaturas exigidas em cada etapa da reação. Os tubos de reação de parede fina fornecem a condutividade térmica desejada, permitindo um equilíbrio térmico mais rápido. Normalmente, os termocicladores têm topos ou tampas aquecidos que evitam a condensação dos componentes da reação no topo do tubo. 

Reação em Cadeia da Polimerase
Figura: Termociclador
https://www.flickr.com/photos/45141485@N04/6358197387/

Requisitos da reação em cadeia da polimerase

  • DNA fragmento a ser amplificado (DNA modelo ou cDNA)
  • Primários (iniciador direto e iniciador reverso) capaz de reconhecer as extremidades do DNA molde. Os primers têm geralmente 18-25 pares de bases de comprimento.
  • Termoestável Polimerase de DNA (Taq Polimerase) catalisa a síntese de DNA. A polimerase Taq é obtida a partir de Termo aquático.
  • nucleotídeos
  • Buffer (fornece um meio ideal para a atividade da DNA polimerase termoestável)
DNA
Figura: DNA é amplificado por PCR
https://www.flickr.com/photos/hinkelstone/33255693331/

Princípio de funcionamento da reação em cadeia da polimerase

A PCR é chamada de reação em cadeia porque as fitas recém-sintetizadas atuam como o modelo para a síntese posterior de DNA nos ciclos subsequentes. 

O PCR consiste em 3 reações sucessivas:

  • Desnaturação do DNA: O processo de desnaturação separa as fitas de DNA de fita dupla. Para o DNA humano, o temperatura de desnaturação é cerca de 93-95oC. A desnaturação do DNA é feita quebrando as ligações de hidrogênio entre as duas fitas polinucleotídicas do DNA. O processo de desnaturação geralmente é realizado por 5 minutos ou tempo prolongado para garantir que ambas as fitas do DNA molde estejam totalmente separadas uma da outra. O processo de desnaturação também ativa a DNA polimerase termoestável.
  • Recozimento de primer: Após desnaturação, os primers direto e reverso são introduzidos na mistura de reação. A solução é então resfriada para o recozimento do primer. Normalmente, o recozimento do primer ocorre entre 50-70oC dependendo da Tm (temperatura de fusão) do DNA. Idealmente, a temperatura de recozimento é 5oC abaixo do Tm. A temperatura de recozimento deve ser baixa para formar um híbrido entre o primer e o DNA molde e alta o suficiente para evitar híbridos incompatíveis. A Tm do DNA depende unicamente do conteúdo de GC e AT do DNA. A etapa de recozimento do primer geralmente leva de 1 a 2 minutos. A Tm pode ser determinada experimentalmente ou calculada teoricamente pela fórmula mencionada abaixo:

Tm = [4 x (G + C)] + [2 x (A + T)]oC

  • Síntese de DNA: A polimerase de DNA termoestável (Taq polimerase) liga-se perto do região de ligação ao RNA e incorpora os nucleotídeos livres alongar e sintetizar uma nova fita de DNA adjacente à fita molde. A temperatura ótima da etapa de extensão depende do tipo de polimerase utilizada; para a Taq polimerase, a temperatura ótima é de cerca de 72oC. A duração deste passo de extensão depende do comprimento do DNA molde e da eficiência da DNA polimerase termoestável; normalmente, é um par de kilobases por minuto.

Todas as reações mencionadas acima são repetidas 30 vezes para obter aproximadamente 1 bilhão de cópias do DNA molde.

PCR WP atualizado 3
Figura: Representação esquemática da amplificação de DNA por reação em cadeia da polimerase
https://www.flickr.com/photos/genomegov/26454931973/

Estágios da reação em cadeia da polimerase

O processo de PCR é dividido em três etapas:

  • Amplificação exponencial: A DNA polimerase desempenha a função ideal e, após a conclusão de cada ciclo, a quantidade de produto é dobrada. Apenas uma pequena quantidade de DNA precisa estar presente no ponto inicial da reação, pois a reação é muito sensível.
  • Estágio de nivelamento: A DNA polimerase mostra menor atividade devido à menor disponibilidade dos reagentes, como os nucleotídeos.
  • Bandeja: não se forma mais produto devido ao esgotamento do reagente.

Usos da reação em cadeia da polimerase

O PCR pode ser utilizado para identificar numerosas anormalidades ligadas ao genoma, uma ampla gama de análises e experimentações. Alguns exemplos do uso de PCR são discutidos abaixo:

  • Identificação de agentes infecciosos como CMV, Micoplasma, Pneumonia, doenças contagiosas e relacionadas a Protozoários, hepatites, etc. na amostra.
  • Determinação de malignidade, especificamente no caso de linfoma e leucemia. 
  • Teste de paternidade e impressão digital genética. 

A PCR permite a identificação precoce de anormalidades que são atualmente as mais desenvolvidas na pesquisa do câncer. As medidas de PCR podem ser realizadas diretamente nas amostras de DNA genômico para reconhecer células malignas específicas de translocação com uma sensibilidade de mais de 10,000 vezes em comparação com qualquer outro método. 

O PCR também identifica microorganismos não cultiváveis ​​e de crescimento lento, como micobactérias, microorganismos anaeróbios e vírus, a partir de técnicas de cultura de tecidos e modelos baseados em animais. As aplicações demonstrativas de PCR em microbiologia são o reconhecimento de patógenos e a capacidade de diferenciar entre cepas não patogênicas de patogênicas identificando os genes específicos. 

O PCR é utilizado para intensificar um pequeno pedaço de uma fita de DNA. Esta fita de DNA pode ser um gene completo ou apenas uma parte de um gene. Ao contrário dos sistemas vivos, o ciclo de PCR pode amplificar apenas pequenos fragmentos de DNA até 10 pares de kilobases. Várias outras técnicas podem amplificar fragmentos de DNA de até 40 kb de tamanho, o que ainda é menor que o tamanho de DNA cromossômico de um eucarioto célula – por exemplo, uma célula humana contém aproximadamente três bilhões de pares de bases de nucleotídeos. 

Teste paterno pode ser realizado usando PCR, tomando o DNA dos indivíduos que têm a disputa. O DNA dos indivíduos testados é amplificado e digerido através de Enzimas de restrição e analisado com eletroforese em gel. O padrão de fragmentos de DNA no gel de agrose é conhecido como a impressão digital de DNA do indivíduo. Indivíduos próximos ou relacionados ao sangue terão um Impressão digital de DNA padrão em comparação com os indivíduos com parentesco distante ou sem parentesco. As impressões digitais obtidas podem ser posteriormente analisadas para o pai-filho ou irmãos com duas ou mais impressões digitais genéticas (DNA). o As impressões digitais de DNA obtidas podem ser usadas para saber as relações evolutivas entre os organismos. 

Seu tamanho pode facilmente reconhecer o produto final do PCR em eletroforese em gel de agarose. A eletroforese em gel de agarose é realizada através da injeção de amostras de DNA no gel de agarose. A corrente elétrica é passada através do gel de agarose para saber a mobilidade das amostras de DNA. Fragmentos menores de DNA movem-se mais rápido no gel e vice-versa. O produto de PCR e o fragmento de DNA da amostra são identificados pela introdução de uma escada de DNA no gel de agarose. A escada de DNA contém moléculas de DNA de tamanho conhecido. 

Anteriormente, a identificação do distúrbio genético pela observação do genoma era uma tarefa difícil. Posteriormente, com o desenvolvimento do PCR, esse processo é abreviado. Qualquer gene de interesse pode ser facilmente amplificado usando iniciadores adequados e, em seguida, sequenciado para detectar mutações no DNA. A identificação precoce de algumas infecções virais letais também pode ser feita por meio de PCR. 

DNA dedo
Figura: impressão digital de DNA é usada para teste paterno
https://www.flickr.com/photos/nasamarshall/33350284091/

Tipos de reação em cadeia da polimerase

Com base em algumas modificações adequadas na técnica, reacção em cadeia da polimerase é classificado nos seguintes tipos:

  • PCR aninhado
  • PCR inverso
  • Transcrição reversa (RT-PCR)
  • PCR assimétrico
  • Quantitativo (PCR-Q-PCR)
  • PCR quantitativo em tempo real (QRT-PCR)
  • PCR Touchdown
  • PCR de colônia
  • PCR específico para alelo
  • Montagem PCR ou Polymerase Cycling Assembly (PCA)
  • PCR assimétrico
  • Linear após o exponencial-PCR (LATE-PCR)
  • PCR dial-out
  • Amplificação dependente de helicase
  • PCR hot start
  • PCR específico entre sequências
  • PCR inverso
  • PCR mediada por ligadura
  • PCR específico para metilação
  • PCR mini-primer

Vantagens da reação em cadeia da polimerase

  • A reação em cadeia da polimerase pode ser usada para a identificação de uma variedade de anormalidades genéticas.
  • O PCR é usado em uma ampla variedade de experimentos e procedimentos de laboratório em biologia molecular.
  • A PCR pode detectar doenças malignas como leucemia, linfoma, etc., e várias outras condições, como Toxoplasma gondi, bacteremia estafilocócica, infecções por malária, etc.
  • A impressão digital genética e os testes de paternidade envolvem a PCR como etapa crucial.
  • A alta sensibilidade e especificidade do PCR o torna uma ferramenta importante para experimentos baseados em biotecnologia e biologia molecular.

Desvantagens da reação em cadeia da polimerase

  • A reação em cadeia da polimerase requer termociclador, montagem eletroforética de DNA, kit de isolamento de DNA e outros produtos químicos caros, que tornam o processo caro.
  • Requer técnicos treinados, qualificados e experientes para a realização de experimentos.
  • Laboratórios de nível básico de segurança com desumidificadores e instalações de fluxo laminar são necessários.
  • É difícil pagar um teste baseado em PCR para o público regular.
  • Nem todas as doenças puderam ser identificadas e diagnosticadas por PCR.
  • Possibilidade de obtenção de resultados falso-positivos e falso-negativos.

A Reação em Cadeia da Polimerase é uma técnica comumente usada e amplamente aceita para a identificação de vários agentes infecciosos letais com sensibilidade e especificidade. O PCR está sendo usado em vários centros médicos de instalações avançadas, laboratórios modernos e institutos médicos como um módulo de diagnóstico e pesquisa de rotina. A reação em cadeia da polimerase desempenha um papel crucial na identificação de anormalidades que representam sintomas clínicos atípicos; O PCR permite a detecção precoce desses tipos de deficiências. A detecção precoce pode ajudar a gerenciar o indivíduo de uma maneira muito melhor, o que pode reduzir a carga social e econômica sobre a família do indivíduo.

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Verificador de conceito MCQs

Pergunta nº 1: Um aluno está realizando PCR para amplificar uma amostra de DNA modelo. Mas ele se esqueceu de adicionar o primer de DNA no experimento. Qual das opções a seguir representa o melhor resultado possível?

A- A reação não ocorrerá.

A reação B funcionará, mas o processo amplificará regiões não específicas (não a porção desejada do DNA do DNA.

C- A reação funcionará, mas a uma taxa prolongada

O D-Reaction funcionará e o produto apresentará mutações indesejadas.

Opção A: “A reação não ocorrerá” é a resposta correta.

Explicação: Os primers são essenciais para o funcionamento da PCR. A Taq polimerase precisa deles para se ligar (na etapa de hibridização) para iniciar Replicação do DNA. Assim, a PCR não funcionará na ausência de primers e nenhuma amplificação ocorrerá.

Pergunta nº 2: Um estudante / pesquisador deseja inserir o gene da hemoglobina humana em um vetor de expressão para clonar e expressar o gene em células de camundongo para análise do fenótipo resultante. Qual das seguintes sequências de procedimentos permitirá ao aluno / pesquisador clonar o gene com sucesso?

Opção A:

1. Amplifique o gene por meio de PCR

2. Use uma enzima de restrição para cortar o vetor de expressão

3. Ligate gene e o vetor digerido

Opção B: 

1. Gene ligante

2. Use uma enzima de restrição para cortar o vetor de expressão 

3. Amplificar o gene e o vetor de expressão digerido via PCR

Opção C:

1. Use uma enzima de restrição para cortar o vetor de expressão

2. Amplifique o gene por meio de PCR

3. Ligate gene e o vetor digerido

Opção D:

1. Use uma enzima de restrição para cortar o vetor de expressão

2. Ligate gene e o vetor digerido

3. Amplificar o gene via PCR

Opção A: É o correta opção 

1. Amplifique o gene por meio de PCR

2. Use uma enzima de restrição para cortar o vetor de expressão

3. Ligate gene e o vetor digerido

Explicação: Primeiramente, usaremos a PCR para amplificar o gene de interesse do genoma humano com sítios de restrição nas extremidades (isso ajudará na sua ligação a uma restrição enzima digerida vetor). Posteriormente, o vetor de expressão precisa ser digerido usando a mesma enzima de restrição e, em seguida, o vetor digerido e o gene amplificado foram ligados. O produto final será constituído por dois segmentos: o vetor original e o gene de interesse.

Pergunta nº 3: Qual instrumento é usado para completar a amplificação de DNA por PCR?

A- Analisador Genético

B- espectrofotômetro UV

C- Termociclador

D- Centrífuga

Opção C: Termociclador é a resposta correta

Explicação: O termociclador pode ser configurado para operar um ciclo dos estágios de desnaturação, recozimento e extensão, respectivamente, em uma pequena quantidade do volume de reação. Um termociclador é usado para realizar a amplificação por PCR.

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